Jak vytvořit TBE vyrovnávací paměť ve 3 jednoduchých krocích

TBE pufr je tlumivý roztok tvořený bází Tris, kyselinou boritou a EDTA (nebo Tris-borát-EDTA dohromady). Tento pufr se často používá pro elektroforézu na agarosovém gelu při analýze produktů DNA, které jsou výsledkem amplifikace PCR, protokolů čištění DNA nebo pokusů o klonování DNA.

TBE pufr je zvláště užitečný pro separaci menších fragmentů DNA (MW <1000), jako jsou malé produkty štěpení restrikčními enzymy.

TBE má větší vyrovnávací paměť a poskytuje ostřejší rozlišení než vyrovnávací paměť TAE. TAE pufr je roztok tvořený bází Tris, kyselinou octovou a EDTA (Tris-acetát-EDTA).

TBE je obecně dražší než TAE a inhibuje DNA ligázu, což může způsobit problémy, pokud se zamýšlí následné purifikační a ligační kroky DNA. S následujícími třemi jednoduchými kroky se naučíte, jak vytvořit vyrovnávací paměť TBE. Na vytvoření tohoto vyrovnávací paměti by nemělo trvat déle než 30 minut. Zde je postup:

Připravte zásobní roztok EDTA

Předem byste měli připravit roztok EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina). EDTA nezačne úplně reagovat, dokud se hodnota pH nezmění na hodnotu přibližně 8. Pro 500 ml zásobního roztoku 0,5 M EDTA zvážíme 93,05 g disodné soli EDTA (FW = 372,2). Pak se rozpustí ve 400 mililitrech deionizované vody a pH se upraví NaOH. Poté se roztok doplní na konečný objem 500 mililitrů.

Připravte zásobní roztok TBE

Vytvořte koncentrovaný (5x) zásobní roztok TBE vážením 54 g Trisové báze (FW = 121,14) a 27,5 g kyseliny borité (FW = 61,83) a rozpustí se v přibližně 900 mililitrech deionizované vody. Potom se přidá 20 mililitrů 0,5 M EDTA (pH 8,0) a roztok se upraví na konečný objem 1 litr.

Tento roztok lze skladovat při pokojové teplotě, ale ve starších roztocích se vytvoří sraženina. Pufr uchovávejte ve skleněných lahvích a vyhoďte, jestliže se vytvořila sraženina.

Připravte pracovní roztok TBE

Pro elektroforézu na agarovém gelu lze použít tlumivý roztok TBE v koncentraci 0,5x (koncentrace koncentrovaného materiálu v poměru 1: 10). Zásobní roztok se zředí 10x v deionizované vodě. Konečné koncentrace solutu jsou 45 mM Tris-boritanu a 1 mM EDTA. Pufr je nyní připraven k použití při běhu agarózového gelu.

Co potřebujete

Pro vytvoření vyrovnávací paměti TBE budete potřebovat pouze čtyři látky. Zbývající položky v tomto seznamu jsou zařízení. Čtyři požadované látky jsou disodná sůl EDTA, báze Tris, kyselina boritá a deionizovaná voda.

Pokud jde o zařízení, budete potřebovat pH-metr a kalibrační standardy. Kromě toho budete potřebovat kádinky nebo baňky o objemu 600 mililitrů a 1500 mililitrů. Zaokrouhlování potřeb vašeho vybavení jsou odměrné válce, míchací tyče a míchací desky.

Zkontrolujte inventář v laboratoři, kterou budete používat, abyste se ujistili, že máte vše, co potřebujete, než začnete. Nic není horší než to, že musíte zastavit uprostřed přípravy řešení, protože jste vyčerpali správné materiály.

Pokud je vaše laboratoř ve škole nebo na pracovišti, zeptejte se správného personálu, zda má všechny položky na skladě. Tímto způsobem můžete ušetřit čas a energii na konci.