Metody pro purifikaci bílkovin

Důležitou součástí biotechnologického výzkumu je použití proteinových inženýrských technik pro návrh nebo modifikaci proteinů s optimalizovanými vlastnostmi pro specifické průmyslové aplikace. K tomu musí vědce být schopen izolovat a purifikovat proteiny, které jsou předmětem zájmu, takže mohou být studovány jejich konformace, substrátové specificity, reakce s jinými ligandy a specifické aktivity.

Požadovaný stupeň čistoty bílkovin závisí na předpokládaném konečném použití bílkovin.

Pro některé aplikace je dostatečný surový extrakt. Pro jiné použití, například v potravinách a léčivých přípravcích, je však nutná vysoká čistota. Pro dosažení tohoto cíle se obvykle používají několik způsobů čištění proteinů v sérii purifikačních kroků.

Každý krok čištění bílkovin obvykle vede k určitému stupni ztráty produktu. Proto ideální strategie pro čištění proteinů je strategie, při níž se dosáhne nejvyšší úrovně čištění v nejmenších krocích. Výběr kroků k použití závisí na velikosti, náboji, rozpustnosti a dalších vlastnostech cílového proteinu. Následující techniky jsou nejvhodnější pro čištění jediného cytosolového proteinu. Purifikace cytosolových proteinových komplexů je komplikovanější a obvykle vyžaduje použití různých metod.

První kroky při čištění

intracelulárních

proteinů (uvnitř buněk) je příprava surového extraktu . Extrakt bude obsahovat komplexní směs všech proteinů z buněčné cytoplazmy a některých dalších makromolekul, kofaktorů a živin. Surový výluh může být použit pro některé aplikace v biotechnologii, avšak pokud je čistota problémem, musí být dodrženy následující kroky čištění. Výtažky surových bílkovin se připravují odstraněním buněčné trosky generované buněčnou lýzou, která se dosahuje pomocí chemikálií a enzymů, sonikací nebo francouzským lisem.

Odpad se odstraní centrifugací a supernatant se regeneruje. Surové přípravky extracelulárních proteinů mohou být získány jednoduchým odstraněním buněk centrifugací.

U některých biotechnologických aplikací existuje poptávka po

termostabilních enzymech

: enzymy, které mohou tolerovat vysoké teploty bez denaturace a při zachování vysoké specifické aktivity. Organismy, které je produkují, se někdy nazývají extremofily. Jednoduchým přístupem k čištění tepelně odolného proteinu je denaturace ostatních proteinů ve směsi zahřátím a následným ochlazením roztoku (čímž se termostabilní enzym nechá v případě potřeby reformovat nebo znovu rozpustit). Denaturované proteiny se potom mohou odstředit. Střední kroky čištění V minulosti byl obvyklým druhým krokem k čištění proteinu ze surového extraktu srážení

v roztoku s vysokou osmotickou pevností (tj.E. roztoky solí). Nukleové kyseliny v surovém extraktu mohou být odstraněny srážením agregátů vytvořených se streptomycin sulfátem nebo protamin sulfátem. Srážení bílkovin se obvykle provádí za použití síranu amonného jako soli.

Různé proteiny se vysráží v různých koncentracích síranu amonného .

Obecně platí, že proteiny s vyšší molekulovou hmotností vysrážené v nižších koncentracích síranu amonného. Srážení soli obvykle nevede k vysoce purifikovanému proteinu, ale může napomoci eliminaci některých nežádoucích proteinů ve směsi a koncentraci vzorku. Soli v roztoku se pak odstraní dialýzou přes porézní celulózovou hadičku, filtraci nebo gelovou vylučovací chromatografii. Moderní biotechnologické protokoly často využívají řadu komerčně dostupných sestav, které poskytují hotová řešení pro standardní postupy. Čištění proteinů se často provádí pomocí filtrů a připravených gelových filtračních kolon. Jediné, co musíte udělat, je postupovat podle pokynů a přidat správný objem správného roztoku a počkat na určitou dobu, zatímco sbíráte eluent (co se vyskytuje na druhém konci sloupce) v čerstvé zkumavce. Chromatografické metody lze aplikovat pomocí sloupcových stolů nebo automatického HPLC zařízení. Separace pomocí HPLC může být provedena metodami reverzní fáze, výměny iontů nebo vyloučení velikosti a vzorky zjištěné pomocí diodového pole nebo laserové technologie.

Vizualizace bílkovin a hodnocení čištění

Chromatografie reverzní fáze

• (RPC) odděluje proteiny na základě jejich relativních

  hydrofobicit

  • . Tato technika je vysoce selektivní, ale vyžaduje použití organických rozpouštědel. Některé proteiny jsou permanentně denaturovány rozpouštědly a během RPC ztratí funkcionalitu. Proto se tato metoda nedoporučuje pro všechny aplikace, zvláště pokud je nezbytné, aby cílový protein udržel aktivitu. Ion-výměnná chromatografie označuje oddělení proteinů na bázi náboje
  • . Sloupky mohou být připraveny buď pro výměnu aniontů nebo výměnu kationtů. Stĺpy aniontové výměny obsahují stacionární fázi s pozitivním nábojem, který přitahuje negativně nabité proteiny. Sloupky kationtové výměny jsou opačné záporně nabité perličky, které přitahují pozitivně nabité proteiny. Eluce cílového proteinu (proteinů) se provádí změnou pH v koloně, což vede ke změně nebo neutralizaci nabitých funkčních skupin každého proteinu. Velikost-vylučovací chromatografie ( gelová filtrace ) odděluje větší proteiny od malých, protože větší molekuly cestují rychleji přes zesítěný polymer v chromatografické koloně. Velké proteiny se nezapadají do pórů polymeru, zatímco menší proteiny se dělají a trvají déle, než se pohybují chromatografickým sloupcem, a to prostřednictvím své méně přímé cesty. Eluát se shromažďuje v sérii trubek, které oddělují proteiny na základě eluční doby. Gelová filtrace je užitečným nástrojem pro koncentraci bílkovinného vzorku, protože cílový protein se shromažďuje v menším elučním objemu než byl původně přidán do kolony.Podobné metody filtrace mohou být použity při výrobě velkých proteinů kvůli jejich nákladové efektivitě.
  • Afinitní chromatografie je velmi užitečnou technikou pro "leštění" nebo dokončení procesu čištění proteinů. Perličky v chromatografické koloně jsou zesíťovány na ligandy, které se specificky váží na cílový protein. Protein se potom odstraní z kolony promytím roztokem obsahujícím volné ligandy. Tato metoda poskytuje nejčistší výsledky a nejvyšší specifickou aktivitu ve srovnání s jinými technikami. SDS-PAGE
  • je polyakrylamidová gelová elektroforéza, prováděná v přítomnosti SDS (dodecylsulfát sodný), který se váže na proteiny a poskytuje tak velký negativní náboj. Vzhledem k tomu, že obvinění všech bílkovin je poměrně stejná, tato metoda je odděluje téměř zcela na základě velikosti. SDS-PAGE se často používá k testování čistoty proteinu po každém kroku v sérii. Vzhledem k postupnému odstranění nežádoucích proteinů ze směsi se sníží počet pásem vizualizovaných na gelu SDS-PAGE, dokud neexistuje pouze jeden pás představující požadovaný protein. Imunoblotting
• je technika vizualizace proteinů použitá v kombinaci s afinitní chromatografií. Jako ligandy na sloupci afinitní chromatografie se používají protilátky pro specifický protein. Cílový protein se ponechá na koloně, pak se odstraní propláchnutím sloupce solným roztokem nebo jinými činidly. Protilátky spojené s radioaktivními nebo barvivovými značkami pomáhají detekovat cílový protein, jakmile se oddělí od zbytku směsi. Zdroje:
• Zubay G. 1988. Biochemistry, 2nd Edition. Macmillan Publishing Co., New York, NY, USA. Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Protein Purification Handbook, Edition AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc., New Jersey, USA. // www. biochemie. uiowa. edu / donelson / databáze% 20items / protein_purification_handbook. pdf.