Jak funguje polymerázová řetězová reakce pro zesílení genů

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je molekulární genetickou technikou pro tvorbu více kopií genu a je také součástí procesu sekvenování genů.

Jak funguje polymerázová řetězová reakce?

Genetické kopie jsou vytvářeny pomocí vzorku DNA a technologie je dostatečně dobrá, aby vytvořila více kopií z jedné kopie genu nalezeného ve vzorku. PCR amplifikace genu pro vytvoření milionů kopií umožňuje detekci a identifikaci genových sekvencí pomocí vizuálních technik založených na velikosti a náboji (+ nebo -) části DNA.

Za řízených podmínek jsou malé segmenty DNA generovány enzymy známými jako DNA polymerázy, které přidávají doplňkové deoxynukleotidy (dNTP) k části DNA známé jako "šablona". Dokonce i menší části DNA, nazvané "primery", se používají jako výchozí bod pro polymerázu. Primery jsou malé umělé kusy DNA (oligomery), obvykle mezi 15 a 30 nukleotidy. Jsou vyrobeny znalostí nebo hádkou o krátkých sekvencích DNA na samotných koncích amplifikovaného genu. Během PCR se DNA sekvence zahřeje a dvojité vlákna se oddělí. Po ochlazení se primery vážou na šablonu (nazývané žíhání) a vytvoří místo pro začátek polymerázy.

Metoda PCR

Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla umožněna objevením termofilů a termofilních polymerázových enzymů (enzymů, které udržují strukturální integritu a funkčnost po zahřátí při vysokých teplotách).

Kroky zahrnuté v metodě PCR jsou následující:

Vytvoří se směs s optimalizovanými koncentracemi DNA templátu, polymerázového enzymu, primerů a dNTP. Schopnost ohřívat směs bez denaturace enzymu umožňuje denaturaci dvojité šroubovice vzorku DNA při teplotách v rozsahu 94 stupňů Celsia.

• Po denaturaci se vzorek ochladí na mírnější rozmezí kolem 54 stupňů, což usnadňuje žíhání (navázání) primerů na šablony s jednovláknovou DNA.

Ve třetím kroku cyklu se vzorek ohřeje na 72 stupňů, což je ideální teplota pro Taq DNA Polymerase, pro prodloužení. Během prodloužení používá DNA polymeráza původní šňůru DNA jako templát pro přidání komplementárních dNTP ke 3 'koncům každého primeru a generuje sekci dvojvláknové DNA v oblasti požadovaného genu.

• Primery, které mají žíhané DNA sekvence, které nejsou přesně shodné, nezůstávají žíhány na 72 stupňů, čímž se omezí prodloužení na požadovaný gen.
• Tento proces denaturace, žíhání a prodloužení se opakuje vícekrát (30-40) krát, čímž se exponenciálně zvyšuje počet kopií požadovaného genu ve směsi.Přestože by tento proces byl poměrně nudný, kdyby byl prováděn ručně, vzorky mohou být připraveny a inkubovány v programovatelném termocykleru, který je nyní ve většině molekulárních laboratoří obvyklý, a kompletní reakce PCR může být provedena za 3-4 hodiny.
• Každý krok denaturace zastaví proces prodloužení předchozího cyklu, čímž zkrátí nový řetězec DNA a udržuje ji přibližně na velikosti požadovaného genu.

Doba trvání prodlouženého cyklu může být delší nebo kratší v závislosti na velikosti požadovaného genu, ale nakonec, opakovanými cykly PCR, většina templátů bude omezena pouze na velikost požadovaného genu , protože budou vyrobeny z produktů obou primerů.

Existuje několik různých faktorů úspěšné PCR, které lze manipulovat za účelem zlepšení výsledků. Nejčastěji používanou metodou pro testování přítomnosti PCR produktu je elektroforéza na agarózovém gelu. Který se používá k oddělení fragmentů DNA na základě velikosti a náboje. Fragmenty se pak vizualizují pomocí barviv nebo radioizotopů.

Evolution

Od objevu PCR byly objeveny DNA polymerázy jiné než původní Taq. Některé z nich mají lepší "korekturní" schopnost nebo jsou stabilnější při vyšších teplotách, čímž se zlepšuje specifičnost PCR a snižují se chyby z vložení nesprávného dNTP.

Některé varianty PCR byly navrženy pro specifické aplikace a jsou nyní používány v molekulárně genetických laboratořích. Některé z nich jsou PCR v reálném čase a PCR s reverzní transkriptázou. Objev PCR také vedl k vývoji DNA sekvenování, DNA otisků prstů a dalších molekulárních technik.