Techniky pro sekvenční DNA

Oblast biotechnologie je neustálou změnou. Rychlý růst a rozvoj špičkového výzkumu závisí na inovacích a kreativitě vědců a jejich schopnosti vidět potenciál v základní molekulární technice a aplikovat je na nové procesy. Příchod PCR otevřel mnoho dveří v genetickém výzkumu, včetně způsobu analýzy DNA a identifikace různých genů na základě jejich sekvencí DNA.

Sekvenování DNA je také závislé na naší schopnosti používat gelovou elektroforézu k separaci řetězců DNA, které se liší velikostí jen o pár párů bází.

Sekvenování DNA

V pozdních sedmdesátých letech byly vynalezeny dvě techniky sekvenování DNA pro delší DNA molekuly. Jednalo se o metodu

Sanger (nebo dideoxy) a metodu Maxam-Gilbert (chemické štěpení). Metoda Maxam-Gilbert je založená na nukleotidově specifickém štěpení chemickými látkami a je nejlépe použita pro sekvenci oligonukleotidů (krátké nukleotidové polymery, obvykle menší než 50 párů párů bází). Metoda Sanger je běžněji používána, protože byla prokázána technicky snadnější aplikace a při příchodu PCR a automatizace techniky se snadno aplikuje na dlouhé řetězce DNA včetně některých celých genů. Tato technika je založena na ukončení řetězce pomocí dideoxynukleotidů během PCR prodlužovacích reakcí.

Sangerova metoda

V metodě Sanger je analyzovaný řetězec DNA použit jako templát a DNA polymeráza je použita v PCR reakci k vytvoření komplementárních řetězců za použití primerů.

Připravují se čtyři různé reakční směsi PCR, z nichž každá obsahuje určité procento analogů dideoxynukleosid trifosfátu (ddNTP) na jeden ze čtyř nukleotidů (ATP, CTP, GTP nebo TTP). Syntéza nového vlákna DNA pokračuje, dokud není začleněn jeden z těchto analogů, přičemž v tomto okamžiku je vlákno předčasně zkráceno.

Každá PCR reakce skončí obsahující směs různých délek řetězců DNA, všechny končící nukleotidem, který byl pro tuto reakci značen dideoxy. Gelová elektroforéza se pak použije k oddělení pramenů čtyř reakcí ve čtyřech samostatných pruzích a určení sekvence původní šablony na základě toho, jaké délky pramenů končí s jakým nukleotidem.

Při automatizované reakci Sanger se používají primery, které jsou označeny čtyřmi různými barevnými fluorescenčními značkami. PCR reakce, v přítomnosti různých dideoxynukleotidů, se provádějí způsobem popsaným výše. Následující čtyři reakční směsi se pak kombinují a aplikují do jediného pruhu gelu. Barva každého fragmentu je detekována pomocí laserového paprsku a informace jsou shromažďovány počítačem, který generuje chromatogramy znázorňující vrcholy pro každou barvu, ze kterých může být určena sekvence DNA templátu.

Metoda automatického sekvenování je typická pouze pro sekvence až do délky přibližně 700-800 párů bází. Nicméně, je možné získat kompletní sekvence větších genů a ve skutečnosti celé genomy pomocí postupných metod, jako je sekvenování Primer Walking a Shotgun.

V

Primer Walking je funkční část většího genu sekvenována metodou Sanger. Nové primery se generují ze spolehlivého segmentu sekvence a používají se k pokračování sekvence části genu, která byla mimo rozsah původních reakcí. Sekvenování sekvencí

vyžaduje náhodný řezání segmentu DNA, který je předmětem zájmu, do vhodnějších (spravovatelných) velikostí fragmentů, sekvenování každého fragmentu a uspořádání kusů na základě překrývajících se sekvencí. Tato technika byla usnadněna použitím počítačového softwaru pro uspořádání překrývajících se kusů.